پژوهش بررسی امکان تولید گیاهان هاپلوئید از طریق کشت میکروسپور در گیاه کلزا

                                                                                                                                        چكیده:

  بوجود آمده است. B.oleracea وB.rapa های كلزا گیاهی آلو تترا پلوئیدست.كه از تلاقی بین گونه                

یكی از روشهای ٬ كشت میكروسپور كلزا و سپس باززایی جنینهای بدست آمده از كشت میكروسپور می باشد. دراین تحقیق که در سازمان انرژی اتمی اجرا شد مشخص گردید که استقاده از تیمارهای مختلف٬ در میزان باززایی جنین ها موثر است. در آزمایش اول اثرتراكمهای مختلف ( ml٬20000 ml30000 وml 40000 ) میكروسپور بر روی جنین زایی میكروسپورهای كلزا در رقم گلوبال مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد كه هر سه تراكم در سطح 1%با هم اختلاف معنی داری دارند . تراكمml 40000 میكروسپور (باتولید 33/1031% جنین) بالاترین و تراكمml 20000 میكروسپور ( با تولید 72/137% جنین) پایین ترین گروه میزان جنین زایی را  داشتند.درحالیکه تراکمml 30000 میکروسپوربا52/413جنین در گروه حدواسط  قرارگرفت.درآزمایش دیگراثراندازه های مختلف جنین بر روی صفات باززایی جنینهای حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا در رقم گلوبال موردمطالعه قرارگرفت٬ که این صفات عبارت بودنداز: 1.تولیدنوساقه:که درجنینهای بزرگتر از 6میلیمتر دارای بیشترین مقدارست. 2.کالزایی برروی لپه:که اندازه های مختلف جنین در سطح 1% و 5% اختلاف معنی داری با هم ندارند. 3.تولیدبرگ:که در جنین های بزرگتر از 6 میلیمتردارای بیشترین مقدارست. 4.تولیدجوانه های نابجا:که درجنینهای 5 تا6 میلیمتری دارای بیشترین مقدارست. 5.ریشه زایی:که در سطح 1%دارای اختلاف معنی داری میباشد . در آزمایش دیگر مطالعه اثر استفاده  از  کاغذ  صافی در  میزان  طول  ریشه  ٬ ارتفاع گیاهچه ودرصد تولید گیاهچه های نرمال در دو رقم گلوبال و آپشن  مورد مطالعه قرار گرفت . نتایج حاصل از این آزمایش در میزان طول ریشه  ٬ارتفاع گیاهچه وتولید گیاهان نرمال بیانگر آنست که در رقم گلوبال در دو حالت با کاغذ و بدون کاغذ فیلتر نسبت به  رقم  آپشن  دارای  طول ریشه و ارتفاع گیاهچه بیشتری بودند . ولی در حالت اثر متقابل نوع رقم  با کاغذ  فیلتر دارای اختلاف معنی داری  نبودند در آزمایش دیگر اثر  استفاده  از شوک  سرمایی بر  روی  درصد تشکیل  گیاهچه های طبیعی در دو رقم گلوبال  و آپشن مورد مطالعه قرار گرفت . که در  این آزمایش مشاهده شد که تشکیل گیاهچه های طبیعی در دمای  4 درجه به مدت 10 روز در دو رقم گلوبال و آپشن با95/55% دارای بیشترین مقدار تولید بودند.                                           

کلمات کلیدی: کلزا٬کشت میکروسپور٬کاغذ فیلتر و باززایی گیاه نرمال        

1-                        مقدمه   :

گیاه كلزا مهمترین گونه زراعی جنس براسیكا (Brassica) میباشد. و ویژگیهای خاص این گیاه یعنی قابلیت كشت در نقاط مختلف ، در صد بالای روغن آن ، كیفیت مطلوب روغن ، كاربرد روغن آن در صنایع نساجی و پلاستیك و نیز استفاده از كنجاله آن در تغذیه دام سبب شده است كه توسعه كشت این گیاه بعنوان نقطه امیدی جهت تامین روغن خام مورد نیاز كشور و رهائی از وابستگی بشمار رود .بطوریكه در حال حاضر كلزا نقطه ثقل طرحهای افزایش تولید دانه های روغنی محسوب میگردد. دانه‎های روغنی قسمت مهمی از تولید محصولات كشاورزی را شامل می‎شوند، چون علاوه بر مصارف صنعتی از لحاظ تغذیه نیز اهمیت بسزایی دارند. سطح زیر کشت دانه‌های روغنی در سال  1383  (بجز کنجد که در سیستم روغن کشی وارد نمی‌شود) 319 هزار هکتار و محصول تولید شده (دانه) حدود 400 هزار تن بوده ‌است. مصرف روغن نباتی در سال 1383 بالغ بر 1180 هزار تن بوده‌است که 170 هزار تن از آن معادل حدود 4/14 درصد، از تولید داخل تامین شده ‌است ( بی نام ، 1382 ).  كلزا به عنوان یك گیاه روغنی با بیش از 40% روغن در دانه از گیاهان مهم جهت توسعه كشت نباتات روغنی وتولید روغن نباتی در ایران است. كلزا با نام علمی Brassica napus  و نام انگلیسی Rapeseed گیاهی از تیره Brassicacea  ( چلیپائیان یا شب بو ) می‎باشد كه پس از سویا و نخل روغنی مقام سوم را در تأمین روغن نباتی جهان به خود اختصاص داده است كه در حدود 7/14% كل تولید روغن نباتی جهان را تأمین می‎كند. این گیاه در برابر خشكی و سرما مقاوم بوده و به دلیل سازگاری، دامنه كشت وسیعی دارد  ( دهشیری 1378 ). روشهای سنتی (كلاسیك) اصلاح نباتات از دیر باز برای تولید گیاهان زراعی برتر مورد استفاده قرار میگرفته است كه مبتنی بر ایجاد تغییر در ساختار ژنتیكی گیاه كامل در جهت هدف خاصی با استفاده از تلاقیهای بین جنسی ودرون جنسی بوده است.

روشهاییكه جهت اصلاح گیاهان خود گشن بكار گرفته میشوند٬ عمدتا روشهای گزینش (Selection) و یا دورگ گیری (Hybridization) است كه در مورد اول از تنوع ژنتیكی موجود در توده های طبیعی و بومی استفاده شده و واریته های اصلاح شده ای كه نسبت به جامعه اولیه برتری هائی از نظر كمی و كیفی دارند بوجود می آیند. شانس موفقیت در این روش نسبتا كم است زیرا به غنای ژنتیكی توده های محلی بستگی دارد كه امروزه رو به كاهش بوده و كمتر قابل دسترسی است. در مقابل روشهای مبتنی بر تلاقی به اصلاحگر این امكان را میدهد كه بطور هدفدار صفات مطلوب واریته های مختلف را با یكدیگر تلفیق نماید(Poehlman and Mitton , 2003).

یك پروژه اصلاح نباتات از زمان انجام دورگ گیری تا آماده شدن واریته جهت كشت ، حدودا 10 تا 15 سال زمان صرف می شود لذا امروزه متخصصین اصلاح نباتات به دنبال روشهائی هستند كه بتوان این مدت زمان را به حداقل ممكن رسانید تا در وقت و هزینه های سنگین برنامه های اصلاح نباتات صرفه جوئی شود. برای این كار سعی بر اینست كه بتوان با ایجاد تغییرات ژنتیكی در سطح سلول ، زمان لازم برای تهیه ارقام پر محصول با كیفیت بالا و مقاوم به بیماری و یا تنشهای محیطی را در برنامه های به نژادی كوتاه كرد(اصلانی و همكاران ، 1381). 

استخراج میكروسپورها

     غنچه‌های استریل شده توسط پنس استریل به داخل كاپ میكروبلندر منتقل شدند. (كاپ میكروبلندر تا 20 دقیقه قبل از شروع آزمایش در فریزر یخچال در دمای صفر درجة سانتی‌گراد نگهداری می شد). پس از انتقال غنچه‌ها به كاپ میكروبلندر ml 30 محیط استخراج میكروسپورها به داخل كاپ اضافه گردید. و سپس كاپ بر روی دستگاه آسیاب نصب گردید. غنچه‌ها طی 3 مرتبة 10 ثانیه‌ای آسیاب شدند. سوسپانسیون حاصل از آسیاب كردن غنچه‌ها در شرایط كاملاً استریل به ترتیب از دو الك آزمایشگاهی با سوراخهایی به قطر 106 و 53 میكرومتر كه بر روی هم قرار داشتند, عبور داده شد. سپس با استفاده از  ml20 دیگر از محلول استخراج میكروسپورها جداره‌های كاپ میكروبلندر و تیغ آن كه آغشته به غنچه‌های آسیاب شده بود شستشو گردید. پس از عبور سوسپانسیون میكروسپورها از الكهای آزمایشگاهی و قرار گرفتن در یك ظرف استریل، سوسپانسیون حاصل توسط پیپت استریل به داخل لوله های شیشه‌ای مخصوص سانتریفیوژ ( هر لوله ml 30 - 25) توزیع گردید. سپس ظروف فوق به داخل رکهای سانتریفیوژ منتقل شدند و رکها در داخل دستگاه سانتریفیوژ قرار گرفتند. لازم به یادآوری است كه رکهای سانتریفیوژ باید قبل از انجام سانتریفیوژ از لحاظ وزنی كاملاً هم وزن باشند تا تعادل آنها در هنگام سانتریفیوژ حفظ گردد.

           فهرست مطالب                                        

عنوان                                                                                                                  صفحه

                                                             فصل اول: مقدمه

مقدمه ------------------------------------------------------------ 2

                                               فصل دوم: بررسی منابع                                    

10 کلزا-------------------------------------------------------------

2-1- خصوصیات کلی وعمومی کلزا---------------------------------------  10  

2-1-1- تاریخچه ومبدا ژنتیکی گیاه کلزا------------------------------------ 10

2-1-2- خصوصیات گیاه شناسی کلزا-------------------------------------   10

2-1-3- کشت و تولید کلزا--------------------------------------------   11

2-1-4- برداشت کلزا------------------------------------------------   13

2-1-5- ارقام وگونه های کلزا------------------------------------------   14

2-1-6- مهمترین گونه های جنس براسیکا----------------------------------   16

2-1-7- اهمیت اقتصادی وصنغتی کلزا-------------------------------------   17

2-2- اصلاح گیاه کلزا------------------------------------------------   18

2-2-1- روشهای اصلاح کلزا-------------------------------------------   18

2-2-2- اهداف اصلاحی کلزا-------------------------------------------   19

2-3- گیاهان هاپلوئید-------------------------------------------------  20

2-3-1- مزایا و کاربردهای هاپلوئیدها--------------------------------------  21

2-3-2- مشکلات ومحدودیت های هاپلوئیدها--------------------------------  22

2-3-3- روشهای تولید گیاهان هاپلوئید-------------------------------------  23

2-3-3-1- تولید خود به خودی (روشهای طبیعی)-----------------------------   23

2-3-3-2- تولید القایی(روشهای آزمایشگاهی)-------------------------------   24

2-3-3-2-1- آندروژنز(نرزایی)-----------------------------------------   24

2-3-3-2-1-1- کشت بساک-------------------------------------------  25

2-3-3-2-1-2- کشت میکروسپور---------------------------------------  25

2-3-3-2-2- ژینوژنز(کشت تخمدان وتخمک)-------------------------------  26

2-3-3-2-3- روش حذف کروموزومی-------------------------------------  27

2-4- کشت میکروسپورهای جدا گردیده کلزا---------------------------------  28

2-5- عوامل موثر بر رویانزایی میکروسپورهای جدا گردیده کلزا--------------------- 29

2-5-1- شرایط رشد، فیزیولوژی و ژنوتیپ گیاه مادری--------------------------- 29

2-5-2- اندازه غنچه--------------------------------------------------  32

2-5-3- مراحل تکاملی میکروسپورها--------------------------------------- 33

2-5-4- تراکم میکروسپور در محیط کشت-----------------------------------  35

2-5-5- ترکیب محیط کشت--------------------------------------------  36 

2-5-6- دما-------------------------------------------------------   40

2-6- مکانیسم رویانزایی-----------------------------------------------  43  

2-6-1- مقدمه-----------------------------------------------------   43

2- 6-2- تقسیم قرینه هسته والقائ رویانزایی---------------------------------  45

2-6-3- حوادث چرخه سلولی در طی رویانزایی میکروسپورها---------------------  47  2-6-4- خانواده های ژنی درگیر با رویانزایی میکروسپورها در کلزا-----------------    47

2-7- عوامل موثر بر باززایی گیاه از رویانهای هاپلوئیدی کلزا----------------------   48

2-7-1- بلوغ ،مرحله رشد ونمو رویانها------------------------------------   48

2-7-2- اندازه رویانها--------------------------------------- ---------  49  

2-7-3- محیط کشت------------------------------------------------   50

2-7-5- BAP وژیبرلیک اسید-------------------------------------------  50  

2-7-6- استفاده از کاغذ فیلتر در محیط کشت یا زراعی-------------------------  51  

2-7-7- زغال فعال-------------------------------------------------- 51

2 -7-8- تیمار ABA و ابگیری رویانها-------------------------------------  51

2-8-  موارد استفاده از کشت میکروسپورکلزا--------------------------------  56

2-8-1- اصلاح نباتات و مهندسی ژنتیک-----------------------------------  56

2-8-2- موتا سیون و انتخاب ------------------------------------------  56

2-8-3- کشت میکروسپوروتکنولوژی  بذر مصنوعی---------------------------  57

2-8-4- سیستم کشت میکروسپور در مطالعات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی------------- 57

2-8-5- استفاده در کشت و امتزاج پروتوپلاستها-----------------------------  57

                                فصل سوم: مواد و روشها

3-1- مواد گیاهی-------------------------------------------------- 60  

3-2- کشت بذور-------------------------------------------------- 60 

3-3- شرایط اتاق رشد----------------------------------------------   60

3-4- مراقبت های زراعی--------------------------------------------   61

3-5- برداشت غنچه ها وتعیین مرحله مناسب میکروسپورها جهت جنین زایی---------  61

3-6- محیط های کشت، ایزولاسیون وباززاییدر کشت میکروسپورهای کلزا-----------  62

3-6-1- محیط ایزولاسیون میکروسپورها----------------------------------  62

3-6-2- محیط کشت میکروسپورها-------------------------------------   62

3-6-3-1- استریل کردن محیط کشت میکروسپورهای کلزا---------------------   62

3-6-4- محیط کشت باززایی ، جنین های حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا-------   63

3-6-5- وسایل مورد نیاز جهت کشت میکروسپورهای کلزا---------------------   68

3-7- روش انجام آزمایش کشت میکروسپورهای کلزا-------------------------   69 

3-7-1- برداشت غنچه ها--------------------------------------------   69

3-7-2- استریل کردن غنچه ها-----------------------------------------  69

3-7-3- استخراج میکروسپورها----------------------------------------- 69

3-7-4- تعیین تراکم میکروسپورها--------------------------------------- 70

3-8- آزمایشات انجام شده--------------------------------------------  71

3-8-1-مطالعه اثرتراکمهای مختلف میکروسپوربرروی جنین زایی میکروسپورهای کلزا---- 71

3-8-2- مطالعه باززایی گیاه در جنین هایی با اندازه های مختلف حاصل از کشت

میکروسپورهای کلزا-------------------------------------------------  72

3-8-3- مطالعه اثراستفاده از کاغذ صافی یا کاغذ فیلتردر میزان ریشه زایی ،ارتفاع گیاهچه ها

ودرصد گیاهچه های نرمال--------------------------------------------- 73 

 3-8-4- مطالعه  اثر استفاده ازشوک سرمایی  بر روی  درصد تشکیل  گیاهچه های طبیعی--  74

3-8-5- تعین سطح پلوئیدی گیاهچه های باززایی شده--------------------------  75

3-9- تجزیه و تحلیل داده ها--------------------------------------------  78

                                فصل چهارم:نتایج وبحث     

4-1- جنین زایی میکروسپورهای کلزا در تراکمهای مختلف میکروسپور در محیط کشت---- 82

4-2- اثراندازه های مختلف جنین برروی صفات باززایی جنین های حاصل ازکشت

میکروسپورهای کلزا--------------------------------------------------  84

4-3- اثراستفاده ازکاغذ صافی یا کاغذ فیلتردر میزان ریشه زایی ،ارتفاع گیاهچه ها

 ودرصد گیاهچه های نرمال--------------------------------------------- 90

4-4- اثر استفاده ازشوک سرمایی  بر روی  درصد تشکیل  گیاهچه های طبیعی----------  97

4-5- پیشنهادات---------------------------------------------------  105

منابع مورد استفاده--------------------------------------------------  107